Das Museum hat seinen Sitz im ehemaligen Abendmahlsaal (Cenacolo) des Klosters, das von den Augustinermönchen neben der Kirche Santo Spirito errichtet wurde. Das großartige gotische Refektorium aus dem 14. Jahrhundert ist der einzige Raum des berühmten Monumentalkomplexes von Santo Spirito, der noch seine Originalstruktur bewahrt. Seine einstige Bestimmung ist an dem im 13. Jahrhundert entstandenen überwältigenden Fresko von Andrea Orcagna und Gehilfen zu erkennen, das die gesamte Ostwand einnimmt; darunter sind Fragmente eines Letzten Abendmahls und oben eine herrliche Kreuzigung zu sehen, die durch ihren trefflichen Erzählstil besticht. Das Fresko zählt nicht nur zu den besten Werken Orcagnas, sondern ist auch eines der größten Wandgemälde des Trecento, die zu uns gelangt sind.